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    • 专利摘要:
    本發明揭示一種預防及治療動脈粥狀硬化的組合物，其包含查耳酮化合物，尤其當查耳酮化合物含有A環2-羥基且B環4’-甲氧基時，可為伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器誘導劑、p44/42絲裂原活化蛋白激酶抑制劑、細胞週期阻斷劑而具有多途徑的抗動脈粥狀硬化作用，且對於人類主動脈平滑肌細胞無毒性。而且，本發明之查耳酮化合物與伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器配體(羅格列酮)具有協同作用能抑制由氧化型低密度脂蛋白所誘導的細胞增生、細胞週期素D1及細胞週期素D3表現、介白素-1β及介白素-6的表現。
    公开号:TW201306829A
    申请号:TW100128614
    申请日:2011-08-10
    公开日:2013-02-16
    发明作者:Yang-Chang Wu；Fang-Rong Chang；Tusty-Jiuan Hsieh；Suh-Hang Juo；An-Shen Lin；Ying-Chi Du
    申请人:Univ Kaohsiung Medical；
    IPC主号:A61K31-00
    专利说明:
    用於治療動脈粥狀硬化的組合物及其製備方法
    本案係關於一種查耳酮組合物及其製備方法，尤其，本案係關於一種預防及治療動脈粥狀硬化的組合物及其製備方法。
    心血管疾病是心臟及血管的症候群，心血管疾病可分為冠狀動脈心臟病、腦血管疾病、周邊動脈阻塞疾病、風濕性心臟病、先天性心臟病、深部靜脈栓塞和肺動脈栓塞。若發生冠狀動脈硬化，則可能引起狹心症、心肌梗塞或猝死，若腦或頸動脈硬化就會導致腎性高血壓甚至尿毒症，而周邊動脈硬化則導致動脈瘤或閉塞性動脈硬化症。因此，動脈硬化與心血管疾病密不可分。
    由於動脈粥狀硬化之病因為高血脂或凝血現象，例如脂多醣體活化細胞素TNF-α、IL-6β，進而刺激平滑肌細胞增生並增加黏附因子的產生。此外，脂多醣體會和內皮細胞或巨噬細胞上的TLR4區域相互作用，隨後活化NF-κB和p44/p42有絲分裂活化促進劑的蛋白酶的路徑，因此脂多醣體所誘發的發炎反應將導致動脈硬化。
    動脈粥狀硬化屬於一種發炎反應，受損的血管內皮細胞會導致血管內皮的屏障和通透性改變，使低密度脂蛋白大量進入內皮細胞內，並產生氧化型低密度脂蛋白，刺激內皮細胞或平滑肌產生化學趨性物質，其吸引單核球進入內皮細胞下空間，轉化成巨噬細胞，將氧化型低密度脂蛋白吞噬而形成泡沫細胞。大量泡沫細胞的堆積使細胞素、生長因子及前列腺素增加，細胞素會刺激血管中層的平滑肌細胞增生並移行至內皮層，分裂繁殖、產生膠原纖維而形成斑塊，吸引血小板等的粘黏、聚集，形成血栓、阻滯血流，臨床上呈現不穩定心絞痛、急性心肌梗塞、中風等急症。
    目前治療動脈粥狀硬化之藥物常為降血脂藥物或抗血栓症藥物。
    降血脂藥物分為4大類：膽酸結合樹脂、纖維酸衍生物、菸鹼酸衍生物及史達汀類藥物。(1)膽酸結合樹脂阻止腸胃道中的膽酸被吸收，以增加肝臟代償性利用膽固醇製造膽酸，減少肝細胞中膽固醇的含量，但可能發生胃腸不適(腹瀉、便秘)之副作用。(2)纖維酸衍生物降低血中三酸甘油脂濃度，可能引發腹痛、腹瀉、噁心、嘔吐及肝功能指數上升等副作用。(3)菸鹼酸衍生物可減少低密度脂蛋白、三酸甘油脂、膽固醇的濃度，並可增加高密度脂蛋白的濃度，但有胃腸不適、高尿酸、痛風、紅疹、肝功能指數增加等副作用，若長期服用可能增加膽結石的機率。(4)史達汀類藥物作為效果最強及最常見的降膽固醇藥物，其抑制肝細胞中膽固醇合成的速率限制酵素，進而減少血中的膽固醇含量，副作用則為肝功能指數上升、頭痛、噁心、疲倦等。
    而抗血栓症藥物分為3類：抗凝血藥、抗血小板藥及血栓溶解劑。抗凝血藥又分為4小類：維生素K拮抗劑、肝素及其衍生物、直接凝血酶抑制劑以及其他類抗凝血藥物。(1)維生素K拮抗劑包括殺鼠靈(Warfarin，曾為滅鼠藥)、雙香豆素等，其化學結構類似維生素K，作用機制在於拮抗維生素K依賴性凝血因子II、VII、IX、X之活性反應，但會產生血尿、胃腸道及腦內出血等副作用。(2)肝素是由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸及D-葡糖醛酸交替組成，其先與抗凝血第三因子結合，進而加速凝血酶之去活性作用，而達成抗凝血作用，其亦可與多種凝血因子IIa、Xa、XIa、XIIa結合，使之失去活性，然而將可能產生出血、過敏反應及血小板缺乏症等副作用。(3)直接凝血酶抑制劑包括水蛭素及bivalirudin等，其中水蛭素是來自水蛭唾線且具有65個胺基酸的蛋白，其在止血作用與抑制血栓形成上扮演關鍵角色，雖然水蛭素為最強的天然凝血酶抑制劑，但其難以由水蛭中提煉而必須以重組生物技術製備。(4)其他類抗凝血藥物的範例包括Ramatroban，其為血栓素受體抑制劑。
    抗血小板藥物又分為5小類：COX抑制劑、腺嘌呤核苷二磷酸受體抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷酸再吸收抑制劑以及凝血脂抑制劑。
    COX抑制劑中的阿斯匹靈(低劑量)可抑制血小板凝集及預防血栓生成，由於阿斯匹靈會減少胃部保護物質的分泌，所以會產生腸胃不適、胃出血等副作用。腺嘌呤核苷二磷酸受體抑制劑中的保栓通(Clopidogrel)會產生胃出血之風險。磷酸二酯酶抑制劑中的Cilostazol可抑制細胞內磷酸二酯酶活性(特別對磷酸二酯酶III有選擇性)和阻礙cAMP的代謝，促使血小板和血管中的cAMP濃度增加，而有抗血小板凝集和血管擴張作用，但有頭痛、腹瀉、噁心、紅疹、血液異常等副作用。腺苷酸再吸收抑制劑中的二呲待摩(Dipyridamole)可抑制血小板致活因子、膠原、腺嘌呤核苷二磷酸等所引起的血小板凝集作用，其副作用為眩暈、頭昏眼花、昏厥、面紅、頭痛、噁心、嘔吐、皮膚發疹、胃絞痛或虛弱等。當二呲待摩與肝素合併使用時，會增加出血之危險。凝血脂抑制劑中的Terutroban可阻斷凝血脂引起的血小板凝集反應及血管收縮，促進內皮功能及具有抗粥狀動脈硬化效果，然而卻具有出血性風險。
    血栓溶解劑的功效在於活化胞漿素、促進纖維蛋白溶解，適用於治療深部靜脈栓塞、肺栓塞、急性心肌梗塞以及急性動脈栓塞，但會造成出血及過敏反應。
    前述兩大類之治療動脈粥狀硬化藥物均有不同的化學結構及多種副作用產生，為了開發新的治療動脈粥狀硬化藥物，並期能避免副作用產生，本案發明人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案發明，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
    本發明合成出多種查耳酮化合物，其對脂多醣體刺激的人類主動脈平滑肌細胞之細胞增生具有不等的抑制效果。此外，當查耳酮化合物1之A環具有鄰位-羥基(2-羥基)且B環具有對位-甲氧基(4’-甲氧基)時，化合物1與其他黃酮類化合物相較具有最佳活性能抑制由氧化型低密度脂蛋白引起之人類主動脈平滑肌細胞增生，對細胞不具毒性且可以抑制發炎反應。而化合物1與伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器配體(例如市售藥物羅格列酮)具有協同作用能抑制由氧化型低密度脂蛋白所誘導的細胞增生、細胞週期素D1及細胞週期素D3表現、介白素-1β及介白素-6的表現。
    因此，本發明提供一種用於治療或預防動脈粥狀硬化之組合物，其包括下列式I之查耳酮化合物：
    其中，R1係為氫，R2至R5分別為氫、羥基、鹵素其中之一，R6、R7、R9、R10分別為氫、羥基、C1-C20烷氧基、苄氧基其中之一，R8為氫、C1-C20烷基、苄基其中之一。
    前述組合物被用於抑制p44/42絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化，而進一步抑制介白素-6(IL-6)及/或介白素-1β(IL-1β)的表現。前述組合物另可被用於活化伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器(PPARγ)，而進一步抑制IL-6及/或IL-1β的表現。活化PPARγ另可進一步抑制細胞週期素D1(cyclin D1)及/及細胞週期素D3(cyclin D3)的表現。
    本發明另提供一種用於增加PPARγ產生之組合物，其包括前述式I之查耳酮化合物以及式I之取代基種類。該組合物用於增加該PPARγ之信使RNA(mRNA)的表現。
    本發明的另一目的為提供一種抑制人類主動脈平滑肌細胞增生及/或發炎反應之藥物組合物，其包括前述式I之查耳酮化合物及PPARγ之配體(ligand)，式I之取代基種類如上所述。
    本案所提出之發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
    實施例
    實驗1、查耳酮化合物之製備
    查耳酮化合物具有A環及B環，為說明方便，A環及B環上之碳原子編號如上所示。
    本發明的查耳酮化合物係以Claisen-Schmidt縮合反應所完成。以查耳酮化合物1為例，其係將2-羥基乙醯苯(273.6 mg,2.01 mmol)、4-甲氧基苯甲醛(279.1 mg,2.05 mmol)、氫氧化鉀(50% w/v,2 ml)及乙醇(100% v/v,20 ml)於室溫攪拌24小時。反應混合物在減壓下濃縮，再以乙酸乙酯及水進行分配萃取。將有機層的溶媒揮發，使用管柱層析法純化殘留物(矽膠：70-230,Merck；正己烷-乙酸乙酯,15:1,比移值Rf=0.2)，以獲得2-羥基-4’-甲氧基查耳酮(查耳酮化合物1,273.6 mg,產率53.6%)，以高效能液相層析儀確認純度高於95%。
    根據前述製備方法所製備的本發明查耳酮化合物1～29如下所述，然而查耳酮化合物並不限於化合物1～29的範例，其他以此製備方法及其精神所製備的查耳酮化合物均屬本發明之範例及保護範圍。

    實驗2：查耳酮化合物1與其他黃酮類化合物之抑制人類主動脈平滑肌細胞增生之活性
    黃酮類化合物骨架由C6-C3-C6所構成，查耳酮(chalcone)也屬於此類結構，一般而言，代表性的活性黃酮類成分可分為6類，包括：黃酮醇(flavonol)、黃烷酮(flavanone)、黃烷三醇(flavan-3-o1)、黃酮(flavone)、異黃酮(isoflavone)、花青素(anthocyanin)。以下為各種黃酮類化合物基本骨架及應用於本發明的範例。

    為了分析各類黃酮類化合物是否抑制人類主動脈平滑肌細胞(簡稱“平滑肌細胞”)增生之活性(以下簡稱“抑制活性”)，以WST-1試劑測定平滑肌細胞之增生及細胞存活度。WST-1試劑是一種四唑鹽類，其在活細胞中可被粒腺體去氫酶切割為formazan。首先，將平滑肌細胞植入96孔盤之培養皿，培養到七成滿後，再將平滑肌細胞置換於含0.5%牛胚胎血清的DMEM培養液進行“同步化”24小時。在有或無加入黃酮類化合物的情況下，以30 μg/ml氧化型低密度脂蛋白(簡稱ox-LDL)刺激平滑肌細胞24小時。最後，加入WST-1試劑至細胞培養液，以ELISA分析儀偵測450 nm波長下之吸光值來測定formazan的總量。以WST-1試劑測定平滑肌細胞之增生及細胞存活度之實驗將用於本發明，以下將不再重複地說明實驗流程。
    請參閱第1圖，為各種黃酮類化合物(5 μg/ml)抑制由氧化型低密度脂蛋白(30 μg/ml)在24小時內引起的平滑肌細胞增生之活性。搭配前述黃酮類化合物之結構式，化合物1、兒茶酚及染料木黃酮具有顯著的抑制活性，且對細胞沒有毒性。番鬱金黃素、檞黃酮、柚配質及表兒茶酚並未有顯著的抑制活性，芹菜配質及葉黃酮會導致平滑肌細胞死亡。比較查耳酮化合物、黃酮醇及黃烷酮類化合物可知：僅化合物1具有抑制活性，但屬於黃酮醇類的番鬱金黃素、檞黃酮以及屬於黃烷酮類的柚配質均不具抑制活性。黃酮醇及黃烷酮類化合物2號碳及3號碳雙鍵的有或無並非是影響活性的關鍵因素，當黃酮醇及黃烷酮類化合物開環成為查耳酮化合物時，才具有抑制活性。化合物1與兒茶酚具有類似的抑制活性，但以化合物1略強。此外，兒茶酚與表兒茶酚的結構差異在於3號碳位置之羥基立體構型不同，但兒茶酚之抑制活性優於表兒茶酚，表示黃烷三醇類化合物3號碳的立體構型與抑制活性有關。在化合物1與異黃酮類化合物的比較中，染料木黃酮之抑制活性與化合物1接近但比大豆黃酮強，由於大豆黃酮與染料木黃酮的結構差異在於5號碳位置是否有羥基，因此異黃酮類化合物之活性與5號碳之取代基有關。
    由於化合物1與其他5類黃酮類化合物相較具有抑制人類主動脈平滑肌細胞增生之活性，並且對細胞不具毒性，因此，以查耳酮化合物1進行下列實驗。
    實驗3：化合物1對氧化型低密度脂蛋白處理之平滑肌細胞的增生率影響
    請參閱第2圖，經30 μg/ml氧化型低密度脂蛋白刺激後，約50%之平滑肌細胞增生。相較於只以氧化型低密度脂蛋白處理之組別，經1、2.5及5 μg/ml化合物1處理之細胞增生率顯著降低，並呈劑量依賴效應。
    實驗4：查耳酮化合物預防、治療動脈粥狀硬化的機轉
    1.化合物1的抑制活性是經由p44/42 MAPK磷酸化
    為了分析化合物1抑制平滑肌細胞增生之機轉，以綠色螢光偵測細胞增生標誌Ki-67蛋白(又稱MKI67)以作為平滑肌細胞增生的指標，其實驗方法係以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞24小時並且同時分別加入5 μg/ml之化合物1或10-5 M之PD98059(ERK 1/2抑制劑)，以小鼠抗-Ki-67單株抗體合併使用DyLightTM488耦合之二級抗體來確認平滑肌細胞增生。此外，另以高度地結合至DNA之DAPI螢光染劑呈現細胞核，於螢光顯微鏡下觀察細胞。以DyLightTM488綠色螢光及DAPI藍色螢光之比例定量增生細胞。
    氧化型低密度脂蛋白顯著地增加平滑肌細胞之Ki-67蛋白之陽性染色效果，而化合物1或PD98059之處理則降低Ki-67蛋白之陽性染色結果，確認化合物1與PD98059均可抑制氧化型低密度脂蛋白引起的平滑肌細胞增生(結果未顯示)。請參閱第3圖，將Ki-67陽性細胞進行定量並將結果轉換為百分比，與未經化合物1處理之氧化型低密度脂蛋白刺激的平滑肌細胞比較，化合物1降低了10%之增生細胞。
    請參閱第4圖，氧化型低密度脂蛋白增加了p44/42 MAPK磷酸化，相反地，化合物1與PD98059均具有抑制p44/42 MAPK磷酸化的類似效果，其指出化合物1的抗細胞增生效果是由p44/42 MAPK訊息傳導路徑調控。
    2.化合物1對IL-1β及IL-6表現之影響
    化合物1的抗發炎效果係以IL-1β及IL-6之mRNA表現測定。以30 μg/ml氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞8小時，並同時以(1) 10-5 M之PD98059、(2) 5 μg/ml羅格列酮、(3) 5 μg/ml化合物1及(4) 5 μg/ml羅格列酮加上5 μg/ml化合物1處理平滑肌細胞。以Trizol試劑抽取平滑肌細胞的總RNA，並以Quant-iTTM RNA試驗套組定量。2 μg的總RNA利用SuperScriptTM III反轉錄酶套組合成出互補DNA(cDNA)。以水稀釋互補DNA至比例為1:9，並使用iQTM SYBR Green Supermix擴增，將互補DNA及引子(primers)加入聚合酶鏈反應混合物至最終體積為20 μl，使用MiniOpticon即時聚合酶鏈反應系統進行聚合酶鏈反應。其中SEQ ID NOs. 1與2配對以擴增出IL-1β基因，SEQ ID Nos. 3及4配對以擴增出IL-6基因，SEQ ID Nos. 5及6配對以擴增出PPARα基因，SEQ ID Nos. 7及8配對以擴增出PPARγ基因，SEQ ID Nos. 9及10配對以擴增出β-actin基因。
    請參閱第5圖(a)及第5圖(b)，氧化型低密度脂蛋白刺激了平滑肌細胞之IL-1β及IL-6 mRNA表現。相較於只以氧化型低密度脂蛋白處理之組別，化合物1明顯地抑制了IL-1β及IL-6 mRNA表現。PD98059及羅格列酮(PPARγ催動劑)這兩組只能抑制細胞之IL-1β mRNA表現，並無法抑制IL-6 mRNA表現。化合物1的抑制效果比羅格列酮更有效。合併使用羅格列酮與化合物1的組別比單獨使用羅格列酮或單獨使用化合物1的組別更具有抑制發炎基因IL-1β及IL-6 mRNA表現的能力。此外，依據第5圖(a)及第5圖(b)的各自6個組別實驗所製備之蛋白質分析結果顯示，IL-1β及IL-6的蛋白質產量與其mRNA表現一致(結果未顯示)。這些結果顯示查耳酮化合物1可協同性地與羅格列酮活化與PPARγ相關之訊息傳導路徑。
    3.化合物1對PPARγ表現之影響
    本實驗是以平滑肌細胞內PPARγ mRNA表現來探討化合物1對於PPARγ的調控機制，以30 μg/ml之氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞2、4、8、24小時，並且在無或有的條件下同時加入5 μg/ml化合物1。請參閱第6圖(a)，氧化型低密度脂蛋白不會刺激PPARγ mRNA表現，化合物1在處理4小時後顯著地增加PPARγ mRNA表現且在8小時後達到高峰。請參閱第6圖(b)，氧化型低密度脂蛋白及化合物1均不會刺激PPARα mRNA表現。其指出化合物1只會活化與PPARγ相關之訊息傳導路徑。
    進一步分析化合物1是否為平滑肌細胞之PPARγ的誘導劑，僅以化合物1刺激細胞，而未以氧化型低密度脂蛋白刺激細胞。請參閱第7圖(a)的柱狀圖及第7圖(b)的西方點漬圖譜，化合物1顯著地增加PPARγ mRNA及蛋白質表現，並呈劑量依賴關係及時間依賴關係。
    4.化合物1協同性地與PPARγ催動劑(agonist)抑制平滑肌細胞之增生
    請參閱第8圖(a)，PD98059或化合物1單獨處理時顯著地抑制由氧化型低密度脂蛋白引起的平滑肌細胞增生，以羅格列酮單獨處理並未顯著地抑制細胞增生。相反地，以羅格列酮及化合物1共同處理平滑肌細胞可比對照組降低約20%之增生率，並且對細胞不具毒性。此抑制細胞增生之效果是因為同時的p44/42 MAPK之抑制作用及PPARγ之活化。請參閱第8圖(b)之西方點漬圖譜，其證實化合物1顯著地抑制p44/42 MAPK磷酸化，然而羅格列酮並未抑制p44/42 MAPK磷酸化。
    5.化合物1協同性地與PPARγ催動劑抑制平滑肌細胞之cyclin D1及cyclin D3表現
    請參閱第9圖，氧化型低密度脂蛋白增加平滑肌細胞的cyclin D1及cyclin D3蛋白表現，PD98059或羅格列酮並未顯著地降低cyclin D1及cyclin D3蛋白質表現。相反地，化合物1顯著地抑制由氧化型低密度脂蛋白誘導的cyclin D1及cyclin D3蛋白質表現。再者，化合物1與羅格列酮同時處理時可進一步降低cyclin D1及cyclin D3蛋白質表現。
    6.小結
    上述的實驗結果證實查耳酮化合物1對於人類主動脈平滑肌細胞具有顯著的抗增生及抗發炎效果，其係經由抑制p44/42 MAPK、抑制cyclin D1及cyclin D3與活化PPARγ的調節路徑所完成。化合物1為PPARγ誘導劑，可成為一種新穎的治療動脈粥狀硬化的先導藥物。化合物1可以藥學上的習知技術加以製造成為不同劑型的藥物組合物或藥品。
    請參閱第10圖，將前述實驗結果以訊息傳導路徑示意圖表示。在人類主動脈平滑肌細胞，氧化型低密度脂蛋白會誘導p44/42 MAPK的磷酸化。化合物1抑制了由氧化型低密度脂蛋白誘導的p44/42 MAPK磷酸化，其指出化合物1透過p44/42 MAPK訊息傳導的去活化抑制了平滑肌細胞增生。
    氧化型低密度脂蛋白會刺激平滑肌細胞之發炎性細胞素IL-1β及IL-6的表現，而化合物1、PD98059及羅格列酮顯著地抑制由氧化型低密度脂蛋白誘導的IL-1β表現，其顯示氧化型低密度脂蛋白引起的IL-1β表現是經由p44/42 MAPK訊息傳導路徑調控，且化合物1對IL-1β的抑制效果可經由此路徑調節。而化合物1的抑制效果又比PD98059更佳，表示化合物1可能還透過其他路徑調節IL-1β表現。羅格列酮(PPARγ配體)藉由降低IL-1β的過度表現而達到抗發炎效果。化合物1顯著地抑制IL-6表現，但PD98059或羅格列酮並未能抑制由氧化型低密度脂蛋白誘導的IL-6表現。以化合物1與羅格列酮共同處理平滑肌細胞比單獨以化合物1處理更可降低IL-6表現，表示化合物1與羅格列酮協同性地調控IL-6表現。
    化合物1會增加PPARγ mRNA表現，而非作用在PPARα。化合物1為PPARγ誘導劑，可增加內生性PPARγ產生，提供給平滑肌細胞上的配體結合。羅格列酮無法顯著地抑制由氧化型低密度脂蛋白誘導的平滑肌細胞增生，但化合物1與羅格列酮共同處理平滑肌細胞與單獨以PD98059、羅格列酮或化合物1處理相較，具有最佳的抑制平滑肌細胞增生效果，其指出僅處理沒有結合標的之配體並不足以活化平滑肌細胞的PPARγ相關路徑。羅格列酮無作用於抑制p44/42 MAPK訊息傳導路徑，而化合物1具有雙重作用，為p44/42 MAPK抑制劑且為PPARγ誘導劑可提供羅格列酮之結合標的。因此，將PPARγ配體與PPARγ誘導劑(例如化合物1)合併給藥可成為治療動脈粥狀硬化的方向。
    氧化型低密度脂蛋白會增加平滑肌細胞的cyclin D1及cyclin D3蛋白表現，其指出平滑肌細胞增生可經由cyclin D1及cyclin D3調節。化合物1顯著地抑制cyclin D1及cyclin D3蛋白表現，PD98059或羅格列酮並未有明顯作用，表示化合物1對cyclin D1及cyclin D3的抑制效果還經由其他路徑調節。化合物1和羅格列酮的共同刺激可進一步降低cyclin D1及cyclin D3表現，其指出PPARγ在細胞週期調控上仍扮演部份角色。實驗結果顯示PPARγ誘導劑(例如化合物1)及PPARγ配體合併給藥可有效降低平滑肌細胞中由氧化型低密度脂蛋白刺激的cyclin D1及cyclin D3表現。
    綜合上述，查耳酮化合物1可經由調控多種訊息傳導路徑而被用於治療動脈粥狀硬化。
    實驗5、各種查耳酮化合物抑制人類主動脈平滑肌細胞增生之活性
    以實驗1中所製備的查耳酮化合物1-29進行不同濃度下對於脂多醣體誘導的平滑肌細胞增生之影響。實驗3中，已證實不同濃度的化合物1(1、2.5及5 μg/ml)皆能使細胞增生率顯著降低，配合平滑肌細胞所能容忍細胞毒性的藥物濃度，選擇與化合物1之取代基相關之查耳酮化合物在不同給藥濃度下進行探討，而不以全部的查耳酮化合物在相同濃度下相互比較。
    請參閱第11圖(a)，為各種查耳酮化合物1、4、7、19～21、23及25於5 μg/ml濃度下，對脂多醣體處理的平滑肌細胞的細胞增生之影響。比較化合物1(B環具有4’-甲氧基)及化合物4(B環具有3’-甲氧基)，兩者的抑制活性接近，其表示甲氧基位於B環的對位或間位皆能促進查耳酮化合物的抑制活性。比較化合物1(A環具有2-羥基)及化合物7(A環不具有2-羥基)，化合物1具有抑制活性，但化合物7沒有抑制活性，表示查耳酮化合物的A環鄰位之羥基對抑制活性有所影響。比較化合物19、20、21及23，其在A環之取代基及其位置均相同，但B環之取代基則不相同，化合物19、20、21及23具有抑制活性，但會造成部分細胞死亡(結果未顯示)。由於化合物1的A環具有2-羥基且具有抑制活性，因此在A環具有5-溴基的化合物19、20、21及23在5 mg/ml濃度下會增加毒性。比較化合物1及化合物25，化合物25在5 mg/ml濃度下會造成平滑肌細胞死亡，推測其毒性可能來自於B環上4，位置的苄氧基。
    請參閱第11圖(b)，為各種查耳酮化合物1、5、10、12、14、24、26～28於2.5 μg/ml濃度下，對脂多醣體處理的平滑肌細胞的細胞增生之影響。比較化合物1(A環不具有4-羥基)及化合物5(A環具有4-羥基)，化合物1具有抑制活性，但化合物5卻無，其表示A環的4-羥基將使抑制活性降低。比較化合物1(B環具有4’-甲氧基)及化合物10(B環不具有4’-甲氧基)，化合物10不具有抑制活性，其表示B環的4’-甲氧基可使查耳酮化合物具有抑制活性。比較化合物1(A環具有2-羥基)及化合物12(A環具有2-溴基)，化合物1的抑制活性優於化合物12，其表示A環為2-羥基的抑制活性比A環為2-溴基更好。比較化合物12(A環具有2-溴基及B環具有4’-甲氧基)及化合物14(A環具有3-溴基及B環具有3’-甲氧基)，化合物12有抑制活性而化合物14則無，其表示在A環及B環分別改變溴基及甲氧基位置未能使化合物之抑制活性優於化合物1。比較化合物1與A環具有2-鹵基的化合物12、26、27、28，化合物1之抑制活性優於化合物12、27，略優於化合物26、28。
    請參閱第11圖(c)，為各種查耳酮化合物1～3、6、8～9、11、13、15～18、22及29於2 μg/ml濃度下，對脂多醣體處理的平滑肌細胞的細胞增生之影響。化合物2、11、15及22會造成部分細胞死亡(結果未顯示)。比較化合物1及化合物2、3，化合物1之抑制活性優於化合物2、3，表示查耳酮化合物的A環4-羥基對抑制活性較無作用。再比較化合物2及3，化合物2在此藥物濃度下具有毒性，化合物3之A環官能基與化合物2一樣，但化合物3之B環具有4’-苄氧基，推測該4’-苄氧基可降低A環4-羥基所造成之毒性。比較化合物3(B環具有4’-苄氧基)及化合物6(B環具有3’-甲氧基)，化合物3具有抑制活性，但化合物6卻沒有活性，其表示查耳酮化合物B環4’號碳位置之特定官能基能增強其抑制活性。比較化合物1及化合物8，在A環沒有特定官能基之化合物8並無活性，而在A環具有2-羥基之化合物1具有活性，因此查耳酮化合物A環上的2號碳位置之特定官能基對其抑制活性具有決定性影響。再者，比較化合物1及化合物9，化合物9並未具有抑制活性，可知單純的查耳酮骨架並未具有活性。比較化合物1及化合物11，化合物11之B環的3’-苄氧基會增加細胞毒性。比較化合物1與化合物13、15、16、17、18及22(A環具有羥基或鹵基取代，B環具有甲氧基或苄氧基取代)，化合物1仍具有最佳抑制活性且對於細胞無毒性。比較化合物1及化合物29，化合物29並未具有抑制活性，再次顯示A環上的2號碳位置之特定官能基對其抑制活性具有決定性影響。
    本領域技術人員可根據前述抑制活性結果，而將各種查耳酮化合物應用於實驗1至4上。意即，可將各種查耳酮化合物與PD98059或羅格列酮進行搭配，應用於治療或預防動脈粥狀硬化。
    本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
    第1圖為各種黃酮類化合物(5 μg/ml)抑制由氧化型低密度脂蛋白(30 μg/ml)在24小時內引起的平滑肌細胞增生之示意圖。控制組為未加入任何藥物或化合物於細胞培養液中之組別。數據表示6次獨立實驗的平均值±標準差。a為與控制組比較之p<0.001，b為與氧化型低密度脂蛋白組比較之p<0.001，c為與氧化型低密度脂蛋白組比較之p<0.01。
    第2圖為1、2.5及5 μg/ml濃度下化合物1抑制由氧化型低密度脂蛋白(30 μg/ml)在24小時內引起的平滑肌細胞增生之示意圖。數據表示6次獨立實驗的平均值±標準差。a為p<0.001。
    第3圖為化合物1及PD98059對於Ki-67蛋白表現之影響。以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞24小時並且同時分別加入5 μg/ml之化合物1或10-5M之PD98059。數據表示3次獨立實驗的平均值±標準差。a為p<0.001。
    第4圖為化合物1及PD98059對於磷酸化與總p44/42 MAPK蛋白表現之影響。以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞15分鐘並且同時分別加入5 μg/ml之化合物1或10-5 M之PD98059。每個組別進行2次獨立實驗。
    第5圖(a)及第5圖(b)為PD98059、化合物1、羅格列對於介白質(a) IL-1β mRNA及(b) IL-6 mRNA表現之影響。以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞24小時並且同時分別加入10-5M之PD98059、5 μg/ml之化合物1、5 μg/ml之羅格列、或化合物1+羅格列酮(各為5 μg/ml)。數據表示3次獨立實驗的平均值±標準差。a為p<0.001，c為p<0.05。
    第6圖(a)及第6圖(b)為氧化型低密度脂蛋白及化合物1對於(a) PPARγ mRNA及(b) PPARα mRNA表現之影響。以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白單獨處理平滑肌細胞2小時、4小時、8小時及24小時，或同時加入5 μg/ml之化合物1。數據表示3次獨立實驗的平均值±標準差。a為與氧化型低密度脂蛋白組比較之p<0.001。
    第7圖(a)及第7圖(b)為僅以0、1、2.5及5 μg/ml化合物1處理平滑肌細胞4及8小時後之(a) PPARγ mRNA表現及(b) PPARγ蛋白表現。數據表示3次獨立實驗的平均值±標準差。a為p<0.001，b為p<0.01。
    第8圖(a)及第8圖(b)為PD98059、化合物1、羅格列酮對於由氧化型低密度脂蛋白引起的(a)細胞增生及(b)磷酸化與總p44/42 MAPK蛋白表現之影響。(a)以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞24小時並且同時分別加入10-5 M之PD98059、5 μg/ml之化合物1、5 μg/ml之羅格列、或化合物1+羅格列酮(各為5 μg/ml)。數據表示6次獨立實驗的平均值±標準差。a為p<0.001。(b)以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白處理平滑肌細胞15分鐘並且同時分別加入5 μg/ml之化合物1或5 μg/ml之羅格列。每個組別進行3次獨立實驗。
    第9圖為氧化型低密度脂蛋白、PD98059、羅格列、化合物1對於cyclin D1及cyclin D3蛋白表現之影響。以30 μg/ml的氧化型低密度脂蛋白單獨處理平滑肌細胞8小時，或同時加入10-5 M之PD98059、5 μg/ml之化合物1、5 μg/ml之羅格列、或化合物1+羅格列酮(各為5 μg/ml)。每個組別進行3次獨立實驗。
    第10圖為化合物1抗動脈粥狀硬化作用機轉之示意圖。實線為促進作用，虛線為抑制作用。
    第11圖(a)、(b)、(c)分別為各種查耳酮化合物於(a) 5 μg/ml、(b) 2.5 μg/ml及(c) 2 μg/ml濃度下，對脂多醣體引起的人類主動脈平滑肌細胞的細胞增生之影響。控制組為未加入任何藥物或化合物於細胞培養液中之組別。
    <110>　高雄醫學大學
    <120>　用於治療動脈粥狀硬化的組合物及其製備方法
    <160>　10
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    <313>　(862)..(884)
    <400>
    权利要求:
    Claims (7)
    [1] 一種用於預防或治療動脈粥狀硬化之組合物，其包括下列式I之查耳酮化合物： 其中，R1係為氫，R2至R5分別為氫、羥基、鹵素其中之一，R6、R7、R9、R10分別為氫、羥基、C1-C20烷氧基、苄氧基其中之一，R8為氫、C1-C20烷基、苄基其中之一。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中該組合物被配置用於抑制p44/42絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)之磷酸化及活化伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器(PPARγ)至少其中之一。
    [3] 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中該p44/42絲裂原活化蛋白激酶之磷酸化被配置用於促進一介白素-6(IL-6)及一介白素-1β(IL-1β)至少其中之一的表現，該伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器被配置用於抑制該介白素-6及該介白素-1β至少其中之一的表現。
    [4] 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中該伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器被配置用於抑制一細胞週期素D1(cyclin D1)及一細胞週期素D3(cyclin D3)至少其中之一的表現。
    [5] 一種用於增加一伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器(PPARγ)產生之組合物，其包括下列式I之查耳酮化合物： 其中，R1係為氫，R2至R5分別為氫、羥基、鹵素其中之一，R6、R7、R9、R10分別為氫、羥基、C1-C20烷氧基、苄氧基其中之一，R8為氫、C1-C20烷基、苄基其中之一。
    [6] 如申請專利範圍第5項所述組合物，其中該組合物被配置用於增加該伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器之信使RNA(mRNA)的表現。
    [7] 一種抑制人類主動脈平滑肌細胞的細胞增生及發炎反應至少其中之一的藥物組合物，其包括下列式I之查耳酮化合物及一伽瑪型過氧化體增殖劑活化受器(PPARγ)配體(ligand)： 其中，R1係為氫，R2至R5分別為氫、羥基、鹵素其中之一，R6、R7、R9、R10分別為氫、羥基、C1-C20烷氧基、苄氧基其中之一，R8為氫、C1-C20烷基、苄基其中之一。
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    US20140194474A1|2014-07-10|
    TWI415600B|2013-11-21|
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